Cryotech® 玻璃化冷冻
产地 日本
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日本
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序号

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订货号

规格

1

玻璃化冷冻套装 101

V-101

平衡液 ES       1.0 mL   * 1

冷冻液 VS       1.0 mL   * 2

冷冻载杆    Cryotec 4

3孔冷冻板 VP   3

2

玻璃化复温套裝 102

W-102

复苏液 TS        1.8 mL   * 1

稀释液 DS        0.5 mL   * 1

清洗液 WS       1.0 mL   * 1

4孔复温板        1

3

玻璃化冷冻液 110 (10人份)

V-110

平衡液 ES        1.8 mL   * 2

冷冻液 VS        1.8 mL   * 4

4

玻璃化复温 205

W-205

复苏液 TS       1.8 mL   * 5

稀释液 DS       1.8 mL   * 1

清洗液 WS      1.8 mL *   2

5

冷冻载杆 Cryotec    10

Cryotec

6

3孔冷冻板 VP     10

VP

7

4孔复温板           10

WP

8

Cooling Rack 玻璃化冷冻箱

CP


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冷冻试剂

1.使用海藻糖替代蔗糖,无内毒素隐患;

2.优化溶液配方与渗透性保护剂浓度更多的冷冻试剂毒性,对细胞更安全;

3.分步平衡设计,减少暴露时间;

4.添加HPC,冷冻的玻璃化更充分;

复苏试剂

1.专利配方,复苏时细胞不粘附载杆;

2.优化配方,复苏时细胞发育率100%;

冷冻载杆

1.采用PET材质,无细胞毒性;

2.宽而韧的冷冻界面,便于微滴操作;

3.宽而长的手柄,便于信息标示;

4.浮雕式标志设计,易于确认载杆面;

5.尖斜形前端方便液氮内操作;

6.封闭式套帽,冷冻保存更安全;

孔盘

1.可全面观察孔内变化,胚胎零丢失;

2.孔槽优化设计,节约操作液;

3.复苏操作过程集中,操作零差错。




Cryotec®玻璃化冷凍操作

一、冷凍

1、材料

Cryotech玻璃化冷凍試劑:平衡液ES 1瓶;玻璃化冷凍液VS 1瓶。Cryotecs冷凍載杆1支;3孔操作板1片。體視鏡(關閉恒溫加熱板功能);碼錶;鑷子/剪刀;200 μl移液器,液氮盒,移卵針等。

2、準備

  2.1 在冷凍操作之前將ES液和VS液在室溫中(25℃)平衡至少1小時;

  2.2 用剪刀打開Cryotec的包裝盒,在Cryotec載杆上寫下卵母細胞/胚胎(以下簡稱細胞)的資訊,同時放置好操作板(圖1);

1. Cryotec载杆放置于操作板

图1.png


2.4 設置好碼錶

2.5從培養箱中取出含有細胞的培養皿。

注意:

1、移卵針從培養皿中吸取細胞時,務必不能使細胞沾上石蠟油。

2、選擇合適內徑的移卵針:

            140~150 µm的移卵針適用於卵母細胞和卵裂期胚胎;

            160~180 µm的適用於囊胚。

        3、囊胚玻璃化最佳時機:囊胚大小在160~200 µm之間,玻璃化冷凍復蘇率最好。

        4、所有溶液在啟用後,保存期為30天。

        5、平衡過程對於2~8細胞胚胎的建議時間是不少於12 min,對於卵母細胞和囊胚(直徑160~200 µm)的建議時間是不少於15 min

        6、從細胞移入VS1中到細胞進入液氮冷凍時間不得超過90秒。其中在VS1液滴中的時間,2~8細胞胚胎不超過30秒,卵母細胞和囊胚不超過40秒;在VS2液滴中,2~8細胞胚胎不超過10秒,卵母細胞和囊胚不超過20秒。

3、平衡(12~15 min

  3.1 分別ESVS於操作板對應孔中,每孔移入300µl試劑(圖2),將蓋子蓋上。


2.操作前准备试剂                             3.ES液平衡

图2.3.png



  3.2 將移卵針插入培養皿培養液滴中(在遠離細胞的地方反復清洗移卵針已確保移卵針管內沒有石蠟油存在),吸取細胞到移卵針中。

  3.3 將附帶少量培養基的細胞放到ES孔的表面,啟動碼錶**。細胞會慢慢沉入底部,細胞體積將會縮小(圖3)。如果細胞上沾有石蠟油,其在沉降過程中將會搖擺不定。如果沾有石蠟油較多,會影響復蘇率,並且影響操作造成細胞丟失。

  3.4 蓋上操作板蓋子,等待皺縮的細胞恢復大小。

4、玻璃化冷凍130/40s

   4.1將細胞和ES液吸取至移卵針中。

  4.2調節體視鏡焦距至液面中段,將細胞和部分ES輕緩地吹吐到VS1液滴一側的中部(圖4),細胞會慢慢上浮至液滴表面。如果細胞上沾有石蠟油,其上浮過程將會非常迅速,影響復蘇率,而且容易造成細胞丟失。


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4.3 棄去移卵針內殘留的ES液,然後從VS1液滴另一側邊緣吸取新的VS液,再吐掉吸取新的VS液以清洗移卵針。

  4.4 細胞漂浮在VS1液滴的表面(圖5),將細胞吸取在移卵針的最前端,從液態表面將移卵針滑移到液滴另一側,將細胞和盡可能少的液體吐在液滴中層。棄去移卵針中的液體,從VS2液滴中吸取新的液體,再吐掉一次,吸取新液體以清洗移卵針。

  4.5 在此過程中細胞會略有上浮,最終懸浮在溶液中層。

  4.6將細胞吸至移卵針的前端。

5、玻璃化冷凍210/20 s

  5.1 將細胞和儘量少的液體吹吐到VS2液滴的中部,用移卵針圍繞細胞輕微地吹打攪動,以混合細胞周圍溶液使其迅速交換先前殘留的溶液。

  5.2 棄去移卵針內VS液,然後從VS2邊緣吸取新的VS液,重複清洗一次(圖5,步6)。


5. VS2清洗卵子/胚胎(步骤5-8

图5.2.png



5.5 在液滴中層將細胞吸到移卵針的前端(圖5,步驟8)。

  5.6 將細胞吐至Cryotec載杆的末端,細胞周圍有微量液體時不必進行液體回吸,有較多液體時要進行液體的回吸(圖6)。如果放置多顆細胞,應使它們散,彼此不聚在一起。


图6.png

6


5.7 立即將載杆浸入到液氮中,緩慢擺動載杆,加速冷卻至無氮氣氣泡冒出。


5.7.png


   5.8 在液氮中蓋上載杆管帽将载杆垂直于液氮中,管帽稍露出液氮面(载杆末端始终浸入液氮中),用手指捏住管帽顺时针往上拧紧。

   5.9也可以將載杆管帽在載杆浸入液氮前蓋上,以避免交叉感染。

5.8.png    5.9.png    5.10.png     5.11.png



二、復蘇

1、材料

Cryotec復蘇試劑:復蘇液TS 1瓶;稀釋液DS 1瓶;清洗液WS1瓶。四孔復蘇板1個。體視鏡(關閉關閉恒溫加熱板功能);碼錶;鑷子;200 µl移液器,液氮盒,移卵針等。

2、準備工作。

  2.1 復蘇前將TS蓋緊蓋子)放入37℃培養箱中平衡溫度至少1小時(建議過夜)。TS試劑不得接觸培養箱中的CO2,否則pH值將改變。

  2.2 復蘇前將DSWS在室溫(25℃)下平衡溫度至少1 小時。

  2.3 在液氮盒中裝入液氮。

  2.4 從液氮桶裡找到要復蘇的載杆,移到液氮盒內,去除載杆帽放好。

  2.5 從培養箱中取出復蘇板和TS,向復蘇板的矩形孔內倒入1.8 ml TS(圖7,步驟1/①)。

7. 复苏步骤(步骤1-3

7..png


3、復蘇(1 min

  3.1 確認浮雕字面朝上,迅速將載杆前端斜向插入TS液中,倒計時1 min(圖71/②)。

  3.2 輕輕晃動載杆,細胞與載杆分離,懸浮在液體中層。

  3.3 確認細胞在TS孔裡。

3.4 等待復蘇過程中向DS孔內加入300 µl DS(圖7,步驟2/①)。蓋上復蘇板蓋子。

4、稀釋(3 min

  4.1 用移卵針從TS孔中吸取細胞,然後吸入約3 mm長的TS液。


3mm.png


  4.2 緩慢地將3mmTS液吐至DS孔最底部(圖8.2),稍等使TS液團穩定,將細胞吐在TS液團中(圖8.3),用自由擴散的方式實現從TSDS的逐步過渡。棄去移卵針中液體,等待3min(圖7,步驟2/②)。此步驟中細胞仍處於皺縮狀態。

8. 逐步更换溶液(稀释)

8.png


  4.3 等待過程中向WS1WS2孔中分別加入300µl WS(圖7,步驟3/①)。蓋上復蘇板蓋子。

5、清洗15min

  5.1用移卵針從DS孔中吸取細胞和長3 mm的溶液。


3mm2.png


  5.2 緩慢地將液體吐至WS1最底部使成液團(圖8.2),再將細胞吐至該液團中(圖8.3),用自由擴散的方式實現從DS液到WS1液的逐步過渡。蓋上復蘇板蓋子等待5min(圖7,步驟3/②)。此過程中細胞將慢慢從皺縮中回復過來。棄去移卵針中的液體。

  5.3 清洗1結束時可以確定皺縮的細胞是否正常復蘇。

6、清洗21min

  6.1 用移卵針從WS1孔中吸取細胞至前端,。

  6.2 將細胞和盡可能少的WS1液吹吐在WS2孔的一側的表面(圖7,步驟3/③)。棄去針管中的液體,從液滴另一側吸取新的液體。

  6.3 當細胞沉入底部時,再次吸取至移卵針前端,吹吐到液體另一側的表面,細胞將再次沉入底部(圖7,步驟3/③)。

  6.4 用移卵針將細胞移入預平衡好的培養皿中恢復培養(Oocyte 2h,囊胚3h),備用。

注意:

1Oocyte復蘇後因為要恢復培養2小時,所以進行冷凍操作的時間點要選擇在新鮮卵子正常進行ICSI的時間前至少2個小時